如果把生物(wù)藥研發-生産-上市這條道路比作(zuò)一場艱苦卓絕的修行，細胞株構建則是征途之始。基于“質(zhì)量源于設計”的理(lǐ)念，我們希望在起點就篩選到一個“天資卓絕，根骨極佳”的細胞株，方方面面都符合預期标準，避免耗時費力的優化工作(zuò)，使得後續的上下遊工藝開發（沒錯，對下遊工藝也很(hěn)重要）、工藝放大、質(zhì)量控制等環節一片通途。

在評價細胞株的各項指标中，表達量高低無疑是通常最受關注的一項。我們的細胞株平台一年要完成15~20個左右穩定細胞株項目（附表. 2020年部分(fēn)穩定細胞株項目類型和表達量），項目大多(duō)為(wèi)單抗和雙特異性抗體(tǐ)，兼有少量融合蛋白。

就以上分(fēn)子結構而言，使用(yòng)CHO-K1細胞株構建平台，經過10-12周的細胞株構建和篩選過程，14天的CD 培養基Fed-batch培養工藝下，細胞群表達量2~6g/L，克隆表達量4~8g/L是符合預期的表達量範圍。當然，極少數的特殊情況下最終的單克隆細胞株表達量低于預期，我們傾向于認為(wèi)該分(fēn)子相對“Difficult to Express”。從Drug Discovery階段成百上千個候選分(fēn)子中，經曆一系列篩選及成藥性評估後脫穎而出的一個或幾個佼佼者，進入到穩定細胞株構建階段後，為(wèi)什麽有的表達量高，有些表達量卻還是低于我們的預期呢(ne)？ 

衆所周知，外源蛋白在宿主細胞中的表達過程即為(wèi)外源基因導入-轉錄-翻譯-蛋白質(zhì)折疊加工分(fēn)泌的過程。然而宿主細胞是活的生命體(tǐ)，微米級别的小(xiǎo)小(xiǎo)生命體(tǐ)内運行着一套精(jīng)巧複雜的自有法則，在大部分(fēn)常規的穩定細胞株構建過程中，我們往往隻能(néng)利用(yòng)脂質(zhì)體(tǐ)、電(diàn)穿孔等方法進行第一步的播種，目的基因進入細胞内部後生根發芽開花(huā)結果等一系列微觀過程則難以掌控。因此，在從基因到蛋白的任意一個步驟出問題，都有可(kě)能(néng)影響最終的細胞株表達量。

有研究建立了一個診斷模型來探究造成細胞株表達量低的因素，具有一定的參考價值。對于一個表達量低于預期的Mab A，可(kě)選取一個表達量正常的Mab B進行對照，利用(yòng)定點整合的方法構建細胞株以最大程度地排除随機整合帶來的基因水平異質(zhì)性。接着進行如下研究：

01

探究表達産物(wù)對細胞是否有影響

利用(yòng)四環素調控表達系統（Tet-on），在細胞群篩選過程中分(fēn)為(wèi)”Induced”(+Dox)和“Not Induced”（-Dox）兩組，再分(fēn)别進行單克隆篩選。篩選出的單克隆進行Fed-batch，比較不同條件下單克隆之間表達量、生長(cháng)、Qp等方面的區(qū)别。在Dox持續存在下，表達被激活，表達産物(wù)持續積累。如若克隆在Dox是否持續存在下，表現有顯著差别，則可(kě)初步判斷因表達産物(wù)的毒性導緻細胞株表達量低。

02

探究基因轉錄水平是否正常

利用(yòng)qRT-PCR檢測細胞株輕重鏈mRNA相對表達水平，與正常表達細胞株進行比較，如若結果有顯著性差别，則可(kě)初步判斷因轉錄水平不足導緻細胞株表達量低。

03

探究目的蛋白的分(fēn)泌情況

利用(yòng)環乙酰亞胺（cycloheximide，CHX）抑制蛋白質(zhì)翻譯，結合Dox的作(zuò)用(yòng)觀察目的蛋白的分(fēn)泌、折疊和降解情況。在CHX和Dox共同存在的情況下，目的基因表達被激活而蛋白質(zhì)合成受到抑制，利用(yòng)Western Blot檢測培養上清中有無目的蛋白輕重鏈條帶。解除CHX抑制後在固定時間間隔同步檢測上清中Mab A&B的輕重鏈表達情況，如二者有顯著性差别，則表明正确折疊和組裝(zhuāng)蛋白不能(néng)正常分(fēn)泌到胞外，從而影響細胞株表達量。

04

探究目的蛋白的折疊裝(zhuāng)配情況

将經CHX處理(lǐ)後的細胞收集裂解，提取胞内總蛋白，觀察細胞内部輕重鏈積累情況，同時關注BiP的積累。BiP是可(kě)與不正确折疊或錯誤組裝(zhuāng)蛋白結合，使其停留在未折疊狀态的一類分(fēn)子伴侶，其積累水平可(kě)作(zuò)為(wèi)内質(zhì)網應激狀态的指征。如觀察到胞内輕鏈或重鏈有相對異常積累，且BiP水平相對較高的現象，則可(kě)判斷目的蛋白在胞内積累導緻細胞株表達量低于預期。

在了解造成細胞株低表達的因素後，我們通過“先天”的手段，如序列優化、表達載體(tǐ)及宿主細胞改造等，可(kě)以一定程度上提高細胞株表達量；“後天”也能(néng)通過對細胞株“私人訂制”的培養工藝在提高表達量方面取得一些成果。然而，在我們孜孜不倦地追求越來越高的細胞株表達量時，不禁引人思考：細胞株的表達量是越高越好嗎？

答(dá)案無疑是否定的。表達量是評價細胞株重要卻不唯一的維度，從整個項目周期來看，Final Clone的确起到了一錘定音的效果，後續的工作(zuò)都必須圍繞着它進行，也因此，在敲定最後的細胞株之前應當為(wèi)未來環節考慮，挑選生長(cháng)理(lǐ)想，代謝(xiè)穩定，産物(wù)質(zhì)量符合要求的細胞株，而不是一味追求高表達量。

此外，基于國(guó)内藥品集采後的現實形勢，成本控制顯得尤為(wèi)重要。有不少研究建立模型以研究抗體(tǐ)産量與生産成本之間動态變化過程。追求高表達細胞株的最現實因素莫過于後續生産的上遊規模和成本，相對于高表達細胞株而言，低表達細胞株無疑使得上遊成本占主導位置，因此提高表達量是優化上遊生産成本的關鍵。有研究表明，當細胞株蛋白表達量從0.5g/L增至5g/L，單抗生産成本大幅度降低。然而對于下遊而言，在同等發酵體(tǐ)積下，細胞株表達量的提高意味着下遊填料量的增大，從而使下遊成本迅速提高。

有研究表明，當細胞株表達量從2 g/L提高到10 g/L時，下遊成本從總支出的48%提高到73%。另有研究指出，當表達量達到5g/L以上時，對成本影響減弱，轉化為(wèi)下遊過程控制主導。因此，對于當下環境而言，或許更需考慮平衡上下遊成本，對于細胞株的表達量，也多(duō)了一個重要的現實考慮因素。

關于細胞株表達量的二三事讨論到此就告一段落了，細胞株表達量這一簡單而直觀的數據背後，還蘊藏着許多(duō)值得思考和探讨的話題，文(wén)中的幾個方面隻是冰山一角，海面下隐藏的信息值得繼續挖掘。通過以上讨論，我們能(néng)更深切地認識到，細胞株構建的工作(zuò)，與其說是在花(huā)園裏尋找一朵最美麗的玫瑰花(huā)，不如說是找到一朵足夠美麗的——美麗，沒有硬傷，這就是我們想要的，适合我們的玫瑰了。

參考文(wén)獻：

1、Tadauchi T，Lam C，Liu L, et al. Utilizing a Regulated Targeted Integration Cell Line Development Approach to Systematically Investigate What Makes an Antibody Difficult to Express. Biotechnol Prog. 2019 Mar;35(2):e2772.

2、Misaghi S, Chang J, Snedecor B. It’s time to regulate: coping with product-induced nongenetic clonal instability in CHO cell lines via regulated protein expression. Biotechnol Prog. 2014;30 (6):1432–1440.

3、Brian Kelley. Industrialization of mAb production technology: The bioprocessing industry at a crossroads. mAbs 2009; 443-452.

4、Farid SS. Economic drivers and trade-offs in antibody purification processes. BioPharm International. 2009;2009(7).

5、Yang O, Qadan M, Ierapetritou M. Economic Analysis of Batch and Continuous Biopharmaceutical Antibody Production: A Review. J Pharm Innov. 2019; 14: 1–19.

6、史策，虞骥，高棟，等.《單抗制備的過程模拟和經濟分(fēn)析》，《化工學(xué)報》.2018(7):3198-3207.

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