中國(guó)倉鼠卵巢（CHO）細胞作(zuò)為(wèi)重組蛋白生産的重要宿主細胞之一，随着細胞系開發和培養工藝的優化，其生産水平已大幅提高。但一直以來，我們對于細胞内重組蛋白生産的分(fēn)泌機制知之甚少。特别是随着新(xīn)一代生物(wù)制劑的開發，複雜而難以表達的（DTE，difficult-to-express）重組蛋白數量也大大增加了。為(wèi)了提高各種重組蛋白的生産，有必要了解蛋白分(fēn)泌途徑中可(kě)能(néng)的限速步驟。

結合本公司瞬轉制備業務(wù)平台大量的抗體(tǐ)、融合蛋白、抗原蛋白的制備實踐經驗，本文(wén)探讨CHO細胞分(fēn)泌途徑中導緻重組蛋白低效分(fēn)泌和聚集的瓶頸，和當前所使用(yòng)的解決策略。

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CHO細胞内重組蛋白的分(fēn)泌途徑

CHO細胞内，重組蛋白的分(fēn)泌起始于多(duō)肽向内質(zhì)網的轉移。新(xīn)合成的肽鏈轉移到内質(zhì)網腔内後，進行折疊和成熟，然後通過内質(zhì)網出芽，運輸到高爾基體(tǐ)上，進行聚糖延伸或磷酸化修飾等，最後分(fēn)泌到胞外（圖1）。嚴格的質(zhì)量控制機制，包括未折疊蛋白反應（UPR，unfolded protein response）和ER相關的蛋白降解（ERAD，ER-associated-protein-degradation）負責調節細胞内的蛋白穩态。

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重組蛋白分(fēn)泌途徑中的潛在瓶頸

細胞内蛋白的分(fēn)泌途徑，每一步都受到嚴格的調控，以保證蛋白的正确加工和分(fēn)泌。但當目标分(fēn)子的轉錄或者翻譯水平過高時，質(zhì)量控制機制可(kě)能(néng)會不堪重負，導緻蛋白分(fēn)泌受阻。此外，與内源性蛋白相比，重組蛋白特别是非天然結構蛋白可(kě)能(néng)更為(wèi)複雜，它在細胞内的正确折疊加工也更具有挑戰性。

重組蛋白在分(fēn)泌途徑的潛在瓶頸包括新(xīn)生肽鏈進入内質(zhì)網的效率低下，信号肽的錯誤切割，未正确折疊導緻的降解或細胞内聚集，内質(zhì)網應激和應激誘導的細胞凋亡和低效的膜泡運輸。多(duō)項研究報告了影響重組蛋白分(fēn)泌導緻蛋白聚集的因素。比如，有研究人員發現，在多(duō)肽轉運到内質(zhì)網的過程中，信号識别顆粒（SRP）複合物(wù)會造成信号肽的錯誤切割，從而導緻輕鏈在内質(zhì)網中聚集，表達量低。由于與輕鏈的組裝(zhuāng)效率低，導緻細胞内重鏈聚集的現象也有所報道。而重組蛋白的胞内累積和内質(zhì)網應激反應誘導蛋白（ER stress-induced proteins）水平的升高，可(kě)能(néng)暗示細胞折疊和分(fēn)泌能(néng)力不足。

對這些由于分(fēn)泌途徑限制導緻的表達量低和蛋白聚集問題，可(kě)以通過細胞工程和培養工藝的優化，提高重組蛋白表達，減少蛋白聚集。

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解決分(fēn)泌途徑瓶頸的方法

3.1 基因工程

利用(yòng)基因工程改善分(fēn)泌途徑，一是通過設計表達載體(tǐ)；二是調控參與目标蛋白從胞漿中的未成熟蛋白（翻譯後）轉變為(wèi)最終形式的成熟蛋白的核心分(fēn)泌機制基因的表達。現階段的研究主要包括新(xīn)生多(duō)肽向内質(zhì)網的轉移、内質(zhì)網腔内的蛋白折疊和膜泡運輸部分(fēn)。

新(xīn)生肽鏈向分(fēn)泌通路的轉移由信号肽引導。信号肽與胞質(zhì)内的信号識别顆粒（SRP，signalrecognition particle）相互結合并識别，引導多(duō)肽鏈到達内質(zhì)網膜，穿過易位子（Translocon）形成的通道進入内質(zhì)網腔，随即信号肽被信号肽酶水解。對于不同的目的蛋白，選擇合适的信号肽，對改善多(duō)肽的轉移、提高表達量和阻止肽鏈的錯誤剪切有着非常重要的作(zuò)用(yòng)。有研究發現，通過與SRP和易位子亞基共表達，可(kě)以促進某些難以表達（DTE，difficult-to-express）蛋白的正确加工，提高表達減少蛋白聚集。

内質(zhì)網是細胞内重要的蛋白質(zhì)合成加工場所。多(duō)肽進入内質(zhì)網後，内質(zhì)網腔内有大量可(kě)溶性的駐留分(fēn)子伴侶和折疊酶，如蛋白二硫鍵異構酶（PDI，protein disulphide isomerase）、BIP、鈣聯蛋白等，輔助和監控多(duō)肽的正确折疊和裝(zhuāng)配。在某些情況下，比如信号肽剪切錯誤時，蛋白質(zhì)的折疊受到影響，導緻大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)堆積于内質(zhì)網，由此引發一系列分(fēn)子伴侶和折疊酶表達上調為(wèi)标志(zhì)的應答(dá)反應，稱為(wèi)未折疊蛋白反應（UPR，unfolded protein response）。這種現象被稱為(wèi)内質(zhì)網應激（ER Stress）。細胞内UPR信号通路的調節元件有XBP-1，ATF4，ATF6等，在發生UPR時，誘導内質(zhì)網伴侶分(fēn)子和折疊酶表達，提高細胞處理(lǐ)未折疊蛋白的能(néng)力。值得注意的是，如果高水平的内質(zhì)網應激條件持續存在，最終會導緻細胞的凋亡。

目前為(wèi)止，有許多(duō)研究者針對這些參與内質(zhì)網上蛋白加工的基因進行了一系列實驗，以評估其對細胞分(fēn)泌的影響。多(duō)數研究表明這些基因的調控對重組蛋白的生産具有積極作(zuò)用(yòng)，但一些研究則報道了相反的觀察結果（見表1）。還有研究者将目光轉向了内質(zhì)網分(fēn)子伴侶保留機制。可(kě)溶性内質(zhì)網分(fēn)子伴侶在細胞器中的定位是由C端KDEL基序介導的，該基序被KDEL受體(tǐ)識别。KDEL受體(tǐ)（KDELR，KDEL receptor）是一個七層跨膜蛋白，在内質(zhì)網和順式高爾基體(tǐ)之間循環，以pH依賴性方式從内質(zhì)網後腔室捕獲錯誤分(fēn)選的分(fēn)子伴侶。研究表明，在CHO細胞過表達KDELR1，可(kě)以提高特别是生産後期的重組蛋白表達。

蛋白在内質(zhì)網正确折疊組裝(zhuāng)後，通過膜泡運輸到高爾基體(tǐ)上，經過進一步加工形成成熟蛋白，再經過高爾基體(tǐ)小(xiǎo)泡運輸分(fēn)泌到胞外。膜泡運輸是真核細胞内蛋白在内膜系統各細胞器轉運的主要方式，主要包括運輸囊泡的出芽、轉運、拴留、錨定和膜融合過程。整個過程受到許多(duō)因子的調控，如Coat、SM、Tether、SNARE和Rab蛋白等。已有研究表明，無論是過表達促進膜泡運輸的基因或敲除負調控膜泡運輸的基因，對重組蛋白的表達都顯示了積極影響。

除了上述常用(yòng)基因工程，最近，microRNA（miRNA）分(fēn)子也被研究用(yòng)于改善重組蛋白生産的分(fēn)泌途徑。miRNA是一類小(xiǎo)的非編碼RNA，通常由~22個核苷酸組成，參與mRNA的表達調控。與傳統的基因工程相比，miRNA的優勢在于可(kě)以同時靶向調控多(duō)個基因和通路，提高了基因工程的控制範圍。比如，在CHO細胞内表達mitosRNA-1987，抗體(tǐ)的表達量提高了~60%，這可(kě)能(néng)是由于mitosRNA-1987同時下調了CerS2和Tbc1D20基因的表達。但同時，由于miRNA靶标衆多(duō)，在靶向我們希望的目标基因時，也可(kě)能(néng)調控了我們不希望被改變的基因表型。因此，鑒定miRNA的結合靶标并了解其功能(néng)，有助于miRNA在細胞基因工程中的應用(yòng)。

3.2 培養基和工藝優化

細胞在生物(wù)反應器中容易受培養環境的影響，包括pH，溫度，滲透壓和溶氧濃度。優化工藝條件可(kě)以有效的提高重組蛋白表達量，緩解蛋白聚集。研究表明，pH和溫度的降低，滲透壓的增加，高溶氧濃度都對表達量和聚集體(tǐ)的減少顯示出積極作(zuò)用(yòng)。

此外，還研究了培養基補充劑對提高蛋白表達，緩解聚集的作(zuò)用(yòng)。研究表明，改變培養基組成（硫酸銅和半胱氨酸水平）包括小(xiǎo)分(fēn)子化學(xué)伴侶如甘油等可(kě)以減少聚集。表明活性劑如吐溫80和海藻糖也可(kě)以阻止聚合。此外，将工藝參數優化和培養基/補料補充劑添加相結合，在提高蛋白表達，減少聚集展示了良好的前景。

最近的蛋白質(zhì)組學(xué)研究揭示了培養工藝和培養基補充劑對分(fēn)泌途徑的影響。比如，當培養溫度從37℃降到33℃時，多(duō)個内質(zhì)網駐留伴侶表達水平差異高達6.7倍。丁酸鈉和丙戊酸通常被認為(wèi)是脫乙酰化酶抑制劑，促進有效轉錄，提高蛋白表達。然而最近的研究發現，它們還可(kě)以正調控内質(zhì)網駐留伴侶和UPR信号通路元件。

在實際應用(yòng)中，還可(kě)以将基因工程和工藝工程系統地聯合起來，以進一步提高重組蛋白生産。例如，在DTE Fc融合蛋白，Sp35Fc的瞬時表達中，以适當比例共轉染内質(zhì)網駐留伴侶CypB，并在轉染後加入0.5mM PBA和1%(v/v)的甘油，可(kě)以在12天的培養中使細胞表達量顯著提高6倍，并且無二硫鍵結合的蛋白聚集。

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其他(tā)

目前解決重組蛋白分(fēn)泌和聚集的方法仍然基于反複不斷的實驗探索。更全面的了解CHO細胞中複雜的分(fēn)泌和折疊途徑，将有助于指出合理(lǐ)優化的方向。測序技(jì )術和多(duō)組學(xué)工作(zuò)的最新(xīn)進展使我們能(néng)夠全面系統的了解細胞機制及其與細胞系和細胞培養工藝的聯系。一些研究已經将組學(xué)數據應用(yòng)于培養基組成或基因工程，以此進行細胞系性能(néng)優化。另一方面，基因編輯工具的進步，也為(wèi)分(fēn)泌途徑中潛在細胞靶點的驗證提供了強大的技(jì )術支持。

引用(yòng)文(wén)獻：

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