導語：

補料作(zuò)為(wèi)fedbatch的營養補充劑，一般由消耗量較大的成分(fēn)組成，如氨基酸、維生素等，其組分(fēn)濃度高，滲透壓高，在批次補料中至關重要，開發極具挑戰性，需要恰當的成分(fēn)，适宜的濃度，所謂藝術難在平衡，在補料開發上亦是如此。目前市面上的商業化補料種類并不多(duō)，市場基本被業界的三巨頭（Gibco、Hyclone、Merck）壟斷，迫于進口産品居高不下的價格，以及未來對于持續性供貨的擔憂，國(guó)産化補料已經順勢崛起。

01

補料的重要性

那補料到底有多(duō)重要，小(xiǎo)編先貼組數據，選擇一款頂尖的商業基礎培養基進行batch培養，同時使用(yòng)商業化補料進行fedbatch作(zuò)為(wèi)對照組，試驗細胞為(wèi)表達某雙抗的CHO-K1單克隆細胞株。

沒有什麽比數據更有說服力的了。Batch培養的細胞也有生長(cháng)對數期、平台期和凋亡期，但凋亡期活率下降很(hěn)快，12天活率僅剩82.4%，表達量是1.24g/L，再看對照組，第11天的表達量達到4.52g/L，第14天活率還有88%。可(kě)見補料在細胞培養及蛋白表達上的重要性。接下來小(xiǎo)編又換了一個基礎培養基（皓陽培養基），進行了相同的實驗。

很(hěn)明顯，換了基礎培養基後，補料仍舊不可(kě)或缺，但是這次使用(yòng)皓陽基礎培養基後，細胞生長(cháng)的狀态稍有改善，第11天的表達量有2.91g/L，能(néng)達到對照組的61%，隻是從11天開始表達量原地不動，細胞隻存活，不表達，也實在是無米可(kě)用(yòng)。兩個小(xiǎo)實驗對比可(kě)以發現，同樣是基礎培養基batch培養，生長(cháng)及表達差距甚遠(yuǎn)，可(kě)能(néng)是基礎中不同的組分(fēn)及濃度造成了這個差異，到底是哪些成分(fēn)的濃度差異導緻，由于商業基礎培養基的成分(fēn)不明确，這裏隻能(néng)是一個迷。

02

補料的搭配組合

一般補料為(wèi)一個主體(tǐ)補料搭配一個堿性補料，堿性補料成分(fēn)比較清晰，為(wèi)幾個難溶性氨基酸，如酪氨酸等。小(xiǎo)編用(yòng)僅含氨基酸、維生素和幾個鹽的補料（皓陽補料），以皓陽培養基為(wèi)基礎，與上述商業化補料進行了比對研究。

使用(yòng)皓陽基礎培養基僅補料商業補料，不補堿性補料，最後表達量為(wèi)2.65g/L，與batch試驗中的結果相當甚至更低，前期細胞生長(cháng)與活率維持與另兩組相似，後期維持很(hěn)差，結束時活率甚至低于batch水平，表達量結果與batch相似，第11天後就停止表達，猜測是商業化補料中完全不含堿性補料中的某個或某幾個氨基酸，導緻細胞前期能(néng)利用(yòng)基礎中的含量進行生長(cháng)和适當的表達，後期不斷補入的營養成分(fēn)由于無法利用(yòng)反而成為(wèi)了負擔。再看皓陽補料，不補堿性補料後，表達量能(néng)達到5.36g/L，而補堿性補料後表達量為(wèi)6.04g/L，比例達到88.7%，可(kě)能(néng)因為(wèi)開發補料中含一定濃度的難溶性氨基酸，但濃度又不夠，有文(wén)獻報道過，将正常補料中的半胱氨酸濃度降低15%後，抗氧化物(wù)谷胱甘肽和牛磺酸等會減少，導緻細胞在後期維持氧化還原的能(néng)力大大降低，活率下降，最終導緻蛋白表達下降，這與本實驗結論一緻。

03

補料對titer影響

皓陽補料第14天表達量有6.04g/L，能(néng)達到商業補料90%以上的水平，勝利在望，小(xiǎo)編不能(néng)停下腳步，這次仍使用(yòng)皓陽基礎，将上述補料中20種氨基酸和11種維生素設了兩個濃度，大部分(fēn)氨基酸濃度差異較小(xiǎo)，在2-5倍之間，個别特殊氨基酸如丙氨酸、甘氨酸酪氨酸等濃度設計差異較大，達到6-7倍以上，維生素的濃度差異較寬，在3倍至100倍之間不等，一共設計了32組PB（Plackett-Burman）試驗，再加一組對照（33号，皓陽基礎+商業補料）。

就不吐槽這個實驗前期培養基配制工作(zuò)有多(duō)複雜，結果卻讓小(xiǎo)編大失所望，所有實驗組均低于對照組，最高的隻有5.15g/L，隻有對照組的80.7%，而最低的為(wèi)2.32g/L，連batch的表達水平都沒達到，這細胞就是這麽任性，營養不對胃口，就不吃也不吐。

雖然實驗沒有預期的結果，小(xiǎo)編也沒有挖掘到什麽有價值的信息，隻感覺添加不同濃度氨基酸和維生素對細胞生長(cháng)影響沒那麽大，但對蛋白表達的影響卻非常大，這次小(xiǎo)編給自己減負，将氨基酸濃度卡住不動，單獨對維生素進行了探索，但濃度範圍作(zuò)了适當的調整，高低在2-200倍之間，設計了12組PB與一組對照（13号，皓陽基礎+商業補料）。

先看對照組，這個皓陽基礎加商業補料的CP組合，從第二個實驗的6.54g/L，到第四個實驗的6.38g/L，再到本次的6.34g/L，可(kě)以說是非常的穩定。實驗組活率到第11天為(wèi)止基本一緻，最後一天表現出了較大的差異，第14天最低活率是19%，最高活率有91%，活細胞密度情況相似，最後一天從22.7E6cells/ml到4.23E6cells/ml，也就是不同的維生素濃度對細胞後期的狀态維持有較大的影響，分(fēn)析得出結果對于活率密度維持及蛋白表達最重要的一個因子是氯化膽堿，這與文(wén)獻報道一緻。

04

補料定制開發對宿主的意義

雖然文(wén)獻早有報道，但小(xiǎo)編還是暗自驚喜，至少有兩款能(néng)與商業補料媲美的補料， fedbatch最後第14天的表達量能(néng)達到6.4g/L，于是小(xiǎo)編又精(jīng)神抖擻，繼續搬磚，這次用(yòng)表達另一蛋白的CHOK1單克隆細胞，選取上述第11（皓陽補料1）和第12号補料（皓陽補料2）進行了試驗。

皓陽基礎搭配商業補料表現依舊出色，表達量為(wèi)最高，達到4.86g/L，但皓陽補料無論是1或2，最後表達量僅有3.5g/L，有點不忍直視。所以可(kě)見，雖為(wèi)同一宿主細胞，不同項目之間的差距，揭示了不同項目量身定制化開發的重要性。

經驗分(fēn)享與感悟

直到現在，因為(wèi)細胞代謝(xiè)的錯綜複雜，我們對它的認知仍是冰山一角，作(zuò)為(wèi)一名工藝人，在開發路上翻山越嶺，披荊斬棘，隻願所有迷惑，皆為(wèi)可(kě)解。

參考文(wén)獻

1.Shinobu Kuwae , Ichiko Miyakawa , Tomohiro Doi , Development of a chemically defined platform fed-batch culture media for monoclonal antibody-producing CHO cell lines with optimized choline content. Cytotechnology .2018 Jun;70(3):939-948.       

2.Amr S. Ali , Rachel Chen , Ravali Raju , Rashmi Kshirsagar. Multi-Omics Reveals Impact of Cysteine Feed Concentration and Resulting Redox Imbalance on Cellular Energy Metabolism and Specific Productivity in CHO Cell Bioprocessing. Biotechnol J.2020 Aug;15(8):e1900565.

關于皓陽生物(wù)

杭州皓陽生物(wù)技(jì )術有限公司成立于2015年11月，是一家從事治療性抗體(tǐ)和重組蛋白藥物(wù)開發服務(wù)的國(guó)家高新(xīn)技(jì )術企業。公司擁有抗體(tǐ)藥物(wù)人源化和成藥性分(fēn)析、穩定細胞株構建、發酵工藝開發、純化工藝開發、制劑處方開發、分(fēn)析方法開發、抗體(tǐ)偶聯藥物(wù)（ADCs）開發、培養基定制開發等多(duō)個藥物(wù)開發平台，建有完善的1000L規模原液和成品GMP生産線(xiàn)，能(néng)夠提供從DNA到IND和臨床Ⅰ、Ⅱ期樣品生産一站式純粹與專業CDMO服務(wù)。公司現有研發實驗室面積5000平方米，總投資近億元。自成立以來，公司為(wèi)國(guó)内外多(duō)個新(xīn)藥研發企業提供生物(wù)藥物(wù)技(jì )術研發服務(wù)，同時與多(duō)家知名醫(yī)藥公司達成戰略合作(zuò)。

 皓陽生物(wù)緻力于通過新(xīn)藥研發，推動生物(wù)醫(yī)藥領域的進步，實現創新(xīn)為(wèi)民(mín)、科(kē)技(jì )惠民(mín)的創業目标。公司立足中國(guó)，實踐 “聆聽 深耕 開拓 共赢”的企業精(jīng)神，努力打造一個行業地位突出，管理(lǐ)先進的現代化企業。