如果将下遊工藝開發看成是爬山,那麽陽離子層析可(kě)以算是最難跨過的山峰之一。陽離子工藝開發過程可(kě)能(néng)會遇到單抗洗脫有兩個洗脫峰的情況,小(xiǎo)編在某項目中就遇到了這一現象,進而對雙峰出現的原因和解決方法進行了文(wén)獻查閱和實驗探索。
01 陽離子層析洗脫雙峰現象
Jing Guo[1], Haibin Luo[2] 等在研究中發現,某些抗體(tǐ)陽離子層析工藝開發時出現洗脫峰雙峰現象(圖1A)[2];将A中的兩個峰分(fēn)别收集、透析後重複陽離子層析過程,發現兩者洗脫圖譜峰形相同(圖1 B)[2],且依然呈現雙洗脫峰現象,即雙峰組分(fēn)無明顯差異;研究者進而發現,在不同上樣載量條件下,洗脫圖譜均為(wèi)相似的雙峰(圖1 C)[2]。這與小(xiǎo)編在項目推進中遇到的情況非常相似。
02 陽離子層析出現雙峰原因
Haibin Luo[2] 等進一步探究了抗體(tǐ)陽離子層析出現雙洗脫峰的原因:組氨酸存在于絕大多(duō)數抗體(tǐ)蛋白中,而組氨酸基團在不同pH緩沖液條件下帶電(diàn)情況也會不同。一個組氨酸殘基的平均pKa是6.0,但組氨酸殘基在疏水環境中通常具有更低pKa和較慢的質(zhì)子化速率。焦碳酸二乙酯(DEPC)可(kě)特異性結合溶劑和蛋白質(zhì)表面未質(zhì)子化的組氨酸殘基,而羟胺可(kě)以去除DEPC對組氨酸的修飾(圖2A)[2];DEPC對組氨酸的修飾過程及羟胺的去組氨酸DEPC修飾過程均不會對抗體(tǐ)結構産生影響,可(kě)通過質(zhì)譜确定被DEPC修飾的組氨酸位點,且DEPC修飾不會對蛋白紫外吸收造成影響(圖2D)[2],即可(kě)通過組氨酸DEPC修飾/去修飾來研究組氨酸對抗體(tǐ)陽離子層析出現雙洗脫峰的影響。如圖2B、2C所示,選擇不同時間/程度的組氨酸DEPC修飾及去DEPC修飾的抗體(tǐ)産物(wù)進行陽離子層析,可(kě)見随着組氨酸DEPC修飾時間/程度的增加,洗脫雙峰現象有所變化直至消失(圖C3基本呈現單洗脫峰)[2];而随着羟胺的去組氨酸DEPC修飾時間/程度的增加,雙峰現象重新(xīn)出現。上述實驗證明抗體(tǐ)序列中的組氨酸是導緻抗體(tǐ)陽離子層析雙洗脫峰的因素。
如圖3A[2]顯示,經質(zhì)譜鑒定,1号組氨酸殘基位于可(kě)變結構域,2-10号組氨酸殘基位于恒定結構域(大多(duō)數單抗都有,但陽離子層析多(duō)數未表現出雙峰現象)。使用(yòng)F(ab’)2蛋白酶切除Fc Region後,對酶切産物(wù)F(ab’)2 進行陽離子層析純化時,同樣出現了雙峰現象(圖3B)。該結果表明F(ab’)2的組氨酸很(hěn)有可(kě)能(néng)是導緻陽離子層析雙洗脫峰的因素,但是并不能(néng)确定是可(kě)變結構域的1号組氨酸還是恒定結構域的2-5号組氨酸的影響。
03 陽離子層析雙峰解決策略
3.1.陽離子填料篩選
Haibin Luo[2]等發現,在相同層析洗脫條件(50mM NaAc,NaCl梯度洗脫)下,使用(yòng)不同的層析填料會有不同的色譜表現:如POROS 50HS和Fractogel SO3-(M)陽離子洗脫出現兩個峰,Nuvia S和Source 30S出現肩峰,而Toyopearl SP 650M為(wèi)單洗脫峰(圖4),即可(kě)通過填料篩選避免工藝中雙峰的産生。
但是詳細對比這幾種填料的具體(tǐ)信息表1,小(xiǎo)編發現陽離子洗脫雙峰現象和填料的基質(zhì)或配基沒有必然的聯系,應該是一種綜合的影響:如Fractogel SO3-(M)和Toyoperal SP 650M的填料基質(zhì)都是聚甲基丙烯酸酯,而一個洗脫有雙峰另一個沒有。Source 30S和Sepharose SP配基相同一個洗脫峰雙峰另一個是肩峰。
3.2洗脫Buffer的選擇
如上所述,小(xiǎo)編在某抗體(tǐ)項目陽離子工藝開發也遇到了雙峰現象,将兩個峰分(fēn)别收集檢測後發現蛋白質(zhì)量沒有顯著差異。因為(wèi)種種原因,本項目無法更換不同基質(zhì)或配基的填料,且通過改變上樣及洗脫pH(圖5a)、增加低鹽淋洗(圖5b)等均無法完全避免雙峰的情況。通過進一步查閱文(wén)獻,小(xiǎo)編發現精(jīng)氨酸可(kě)以改變蛋白和填料作(zuò)用(yòng)力,于是嘗試了一下發現洗脫液中添加一定濃度的精(jīng)氨酸,确實可(kě)以避免陽離子層析雙洗脫峰的産生(圖5c、5d);該工藝經中試250L培養體(tǐ)積的下遊純化生産驗證,證明工藝穩定性及可(kě)放大性良好。
關于精(jīng)氨酸和抗體(tǐ)相互作(zuò)用(yòng)從而影響抗體(tǐ)洗脫的原理(lǐ)也有很(hěn)多(duō)研究和報道[3]。精(jīng)氨酸含有胍基團和一個兩性分(fēn)子,有研究者對比研究了胍和精(jīng)氨酸對蛋白層析表現的影響。圖6 a顯示的是胍對研究蛋白在Capto MMC層析洗脫的鹽濃度的影響:根據圖a中黑色和灰色高度對比,可(kě)見加入0.035M 胍濃度對層析洗脫鹽濃度有較大影響,部分(fēn)蛋白洗脫鹽濃度增加,部分(fēn)蛋白洗脫鹽濃度降低;b顯示的精(jīng)氨酸對研究蛋白在Capto MMC層析洗脫鹽濃度影響:可(kě)見在加入0.035M 精(jīng)氨酸後多(duō)數蛋白洗脫鹽濃度顯著降低,即精(jīng)氨酸對洗脫鹽濃度有顯著影響,可(kě)以降低蛋白洗脫的鹽濃度。a和b的對比說明精(jīng)氨酸中的胍基對蛋白的色譜表現有一定影響,但精(jīng)氨酸整體(tǐ)分(fēn)子對蛋白洗脫的的影響作(zuò)用(yòng)更加具有規律性,Capto MMC層析中能(néng)夠降低蛋白的洗脫鹽濃度。
Siddharth Parimal,等利用(yòng)分(fēn)子動力學(xué)(Molecular Dynamics,MD)模拟研究胍和精(jīng)氨酸與蛋白質(zhì)的相互作(zuò)用(yòng),圖7[3]結果顯示胍和精(jīng)氨酸會與蛋白表面帶正負電(diàn)的基團同時存在相互作(zuò)用(yòng),進而影響蛋白的表面電(diàn)荷分(fēn)布。
Siddharth Parimal還通過電(diàn)荷間相互作(zuò)用(yòng)來分(fēn)析胍和精(jīng)氨酸對蛋白和填料結合的影響。精(jīng)氨酸和胍都含有帶正電(diàn)荷的基團。胍和精(jīng)氨酸分(fēn)子的胍基與Capto MMC配體(tǐ)有靜電(diàn)相互作(zuò)用(yòng)。圖8 a顯示沒有精(jīng)氨酸和胍添加的蛋白和填料相互作(zuò)用(yòng),蛋白隻有帶正電(diàn)基團能(néng)與填料相結合;圖8 b顯示胍對蛋白和填料相互作(zuò)用(yòng),胍帶正電(diàn)可(kě)以分(fēn)别結合填料和蛋白的負電(diàn)基團,改變填料和蛋白之間的結合位點,從而影響蛋白和填料的相互作(zuò)用(yòng)力。對不同性質(zhì)的蛋白起到增大或減少與填料結合力的效果;圖8 c顯示精(jīng)氨酸也可(kě)以同時結合蛋白或者填料。由于精(jīng)氨酸分(fēn)子比胍分(fēn)子大很(hěn)多(duō),精(jīng)氨酸與蛋白結合後由于空間位阻會導緻蛋白無法和填料相結合,降低了蛋白和填料之間的結合力,使蛋白可(kě)以更低的鹽濃度洗脫。
Siddharth Parimal用(yòng)分(fēn)子動力學(xué)和電(diàn)荷相互作(zuò)用(yòng)分(fēn)析精(jīng)氨酸和胍會和蛋白的表面帶電(diàn)基團相互作(zuò)用(yòng),結果表明在層析時加入精(jīng)氨酸和胍會改變蛋白和填料之間的結合作(zuò)用(yòng)力。精(jīng)氨酸由于分(fēn)子較大同時帶有正負電(diàn)基團對蛋白結合影響更顯著,可(kě)降低陽離子層析蛋白洗脫的鹽濃度。
04 總結
抗體(tǐ)陽離子層析出現雙洗脫峰,可(kě)能(néng)與抗體(tǐ)序列中組氨酸有關系。可(kě)以嘗試通過篩選不同的填料來解決;也可(kě)嘗試在洗脫液中加入精(jīng)氨酸或直接精(jīng)氨酸洗脫,通過改變蛋白和填料的結合力,來避免雙洗脫峰的産生。
參考文(wén)獻
[1]Jing G , Creasy A D , Barker G , et al. Surface induced three-peak elution behavior of a monoclonal antibody during cation exchange chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 2016, 1474:85-94
[2]Luo H , Cao M , Newell K , et al. Double-peak elution profile of a monoclonal antibody in cation exchange chromatography is caused by histidine-protonation-based charge variants[J]. Journal of Chromatography A, 2015.
[3] Parimal S , Garde S , Cramer S M . Effect of guanidine and arginine on protein-ligand interactions in multimodal cation-exchange chromatography.[J]. Biotechnology Progress, 2016.
關于皓陽生物(wù)
杭州皓陽生物(wù)技(jì )術有限公司成立于2015年11月,是一家從事治療性抗體(tǐ)和重組蛋白藥物(wù)開發服務(wù)的國(guó)家高新(xīn)技(jì )術企業。公司擁有抗體(tǐ)藥物(wù)人源化和成藥性分(fēn)析、穩定細胞株構建、發酵工藝開發、純化工藝開發、制劑處方開發、分(fēn)析方法開發、抗體(tǐ)偶聯藥物(wù)(ADCs)開發、培養基定制開發等多(duō)個藥物(wù)開發平台,建有完善的250L,500L,1000L規模原液和成品GMP生産線(xiàn),能(néng)夠提供從DNA到IND和臨床Ⅰ、Ⅱ期樣品生産一站式純粹與專業CDMO服務(wù)。公司現有研發實驗室面積8000平方米,總投資1.5億元。自成立以來,公司為(wèi)國(guó)内外多(duō)個新(xīn)藥研發企業提供生物(wù)藥物(wù)技(jì )術研發服務(wù),同時與多(duō)家知名醫(yī)藥公司達成戰略合作(zuò)。
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