CHO細胞作(zuò)為(wèi)治療性抗體(tǐ)表達的最主要宿主細胞系，目前70%以上的治療性抗體(tǐ)都是由CHO細胞生産的。同樣的以CRISPR/Cas9為(wèi)代表的基因編輯技(jì )術是當下對細胞基因組進行靶向改造的最簡單最有效的方法。因此，通過基因編輯技(jì )術對CHO細胞進行工程改造應運而生。

01基因編輯簡介

上世紀50年代沃森和克裏克提出DNA雙螺旋結構模型以來，分(fēn)子生物(wù)學(xué)的快速發展，讓我們對基因的了解從宏觀推進到了分(fēn)子層面。而以上世紀90年代鋅指核酸酶（ZFN,Zinc finger nuclease)基因編輯技(jì )術的發明為(wèi)起點，直到本世紀初TALEN（Transcription activator-like effector nucleases）以及CRISPR/Cas9等基因編輯技(jì )術的相繼發明，則讓我們人類得以竊取了一絲上帝造物(wù)的權柄。

目前的基因編輯技(jì )術分(fēn)為(wèi)兩類：CRISPR/Cas9，以及其它。CRISPR/Cas9技(jì )術自誕生以來，以其無與倫比的簡單，高效，快捷等特點，成為(wèi)了當前最“炙手可(kě)熱”的基因編輯工具。2020年的諾貝爾化學(xué)獎和NCBI上多(duō)達15000篇的相關論文(wén)已經說明了一切。鑒于該技(jì )術詳盡的介紹在搜索引擎上随處可(kě)見，我無意在此多(duō)費筆(bǐ)墨，請讀者們自行查閱。

典型的基因編輯工具都由兩個功能(néng)域組成：一個由氨基酸（ZFN,TALEN）或RNA（CRISPR/Cas9）介導的可(kě)編碼的序列特異性DNA結合模塊，負責對靶序列的識别；一個具有DNA内切酶活性的可(kě)切割DNA雙鏈的模塊，導緻DNA雙鏈斷裂（DNA double strand breaks, DSBs)。DSBs出現後，細胞自身的DNA修複機制啓動，對斷裂的雙鏈進行同源（Homology directed repair, HDR)或非同源末端修複（Non-homologous end joining, NHEJ)。非同源末端修複極易出錯，會帶來堿基的缺失或插入，導緻移碼突變或者終止密碼子出現，由此對基因功能(néng)造成破壞，達到基因敲除的目的。而轉入帶有DNA雙鏈斷裂兩端同源臂的修複模闆（Repair template），則可(kě)通過同源末端修複達到外源基因的定點插入。

02抗體(tǐ)的ADCC效應與岩藻糖修飾

抗體(tǐ)依賴的細胞介導的細胞毒作(zuò)用(yòng)（ADCC，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity ）是指抗體(tǐ)的Fab段結合病毒感染的細胞或腫瘤細胞的抗原表位，其Fc段與殺傷細胞（NK細胞、巨噬細胞等）表面的Fc受體(tǐ)結合，介導殺傷細胞直接殺傷靶細胞。抗體(tǐ)通常通過鉸鏈區(qū)及CH2區(qū)域和Fcγ受體(tǐ)結合。CH2結構域的Asn-N297糖基化位點的糖型成分(fēn)（如乙酰葡糖胺，甘露糖，岩藻糖和唾液酸等）決定CH2結構的穩定性及結合特性。有研究顯示降低Asn 297的岩藻糖修飾比例可(kě)顯著增加抗體(tǐ)對殺傷細胞上CD16（Fcγ受體(tǐ)IIIa）的親和力，并最終增加ADCC效應。

通過在CHO細胞培養基中添加抗體(tǐ)岩藻糖基化通路上相關酶的抑制劑或者岩藻糖類似物(wù)（如2FF）能(néng)降低抗體(tǐ)的岩藻糖基化水平，但是對于不同的抗體(tǐ)分(fēn)子，往往需要通過優化添加劑的添加時間以及添加濃度才能(néng)達到理(lǐ)想的岩藻糖基化水平，并且在細胞工藝放大過程中的穩定性也有待考察。此外這些添加劑往往價格高昂，會顯著提升生産成本。

03基因編輯技(jì )術敲除CHO細胞fut8基因

如何才能(néng)快速穩定的生産低岩藻糖基化的抗體(tǐ)？我們通過查閱文(wén)獻注意到抗體(tǐ)的岩藻糖基化是糖蛋白翻譯後修飾的一個普遍過程，核心岩藻糖基化即向N-糖鏈的核心五糖結構(GlcNAc2Man3)還原端第一個N-乙酰葡糖胺上添加一個α-1,6連接的岩藻糖，而岩藻糖基轉移酶Fut8，是唯一一個能(néng)催化形成α-1,6岩藻糖苷鍵的岩藻糖基轉移酶。因此，如果能(néng)敲除CHO細胞基因組内表達該酶的基因，CHO細胞即可(kě)生産理(lǐ)論上無岩藻糖修飾的抗體(tǐ)。

據此，我們采用(yòng)基因編輯技(jì )術，敲除了CHO-K1細胞基因組内的兩個fut8等位基因。利用(yòng)敲除fut8基因後的細胞進行瞬時轉染表達，并評估抗體(tǐ)的表達量和岩藻糖基化水平。

從上述數據我們可(kě)以看出，野生型的CHO-K1細胞系通過平台工藝表達的抗體(tǐ)，岩藻糖基化水平在75%以上；通過2FF工藝，岩藻糖基化水平在15%以下；而fut8基因敲除的細胞系Fut8-KO-CHO-K1采用(yòng)平台工藝表達的抗體(tǐ)其岩藻糖基化水平穩定保持在1.5%以下。從多(duō)個不同項目分(fēn)子，我們可(kě)以發現無論是采用(yòng)2FF工藝，還是用(yòng)Fut8-KO-CHO-K1細胞，其表達量都明顯低于采用(yòng)平台工藝的CHO-K1細胞的表達量，推測是由于岩藻糖比例降低，影響了細胞内與抗體(tǐ)轉錄、翻譯或者分(fēn)泌相關的蛋白的活性，從而導緻整體(tǐ)表達量降低。從mAb2，mAb3項目我們可(kě)以看到，Fut8-KO-CHO-K1細胞的表達水平不低于采用(yòng)2FF工藝的野生型CHO-K1細胞的表達水平，這可(kě)以證明fut8基因的缺失，并未從其它方面影響CHO細胞的生理(lǐ)活動。

04結語

當前，工業界仍習慣于通過随機整合的方式來構建穩轉細胞株，通過培養工藝優化的方式來提高抗體(tǐ)的表達量和質(zhì)量，然而，随着基因編輯技(jì )術的不斷完善和發展，其操作(zuò)越來越簡單、高效。通過外源基因定點插入轉錄熱點區(qū)域來構建穩轉細胞株，或者通過基因編輯技(jì )術來敲入或敲除抗體(tǐ)轉錄、翻譯、翻譯後修飾、分(fēn)泌等相關的基因來調節抗體(tǐ)的表達量和質(zhì)量，這些方法的開發和研究正在如火如荼的進行，想必不久的将來會在工業界得到良好的應用(yòng)。本文(wén)通過基因編輯技(jì )術構建了一個能(néng)表達低岩藻糖修飾水平蛋白的CHO細胞系，就提供了一個很(hěn)好的例子。

END

關于皓陽生物(wù)

杭州皓陽生物(wù)技(jì )術有限公司成立于2015年11月，是一家從事治療性抗體(tǐ)和重組蛋白藥物(wù)開發服務(wù)的國(guó)家高新(xīn)技(jì )術企業。公司擁有抗體(tǐ)藥物(wù)人源化和成藥性分(fēn)析、穩定細胞株構建、發酵工藝開發、純化工藝開發、制劑處方開發、分(fēn)析方法開發、抗體(tǐ)偶聯藥物(wù)（ADCs）開發、培養基定制開發等多(duō)個藥物(wù)開發平台，建有完善的250L,500L,1000L規模原液和成品GMP生産線(xiàn)，能(néng)夠提供從DNA到IND和臨床Ⅰ、Ⅱ期樣品生産一站式純粹與專業CDMO服務(wù)。公司現有研發實驗室面積8000平方米，總投資1.5億元。自成立以來，公司為(wèi)國(guó)内外多(duō)個新(xīn)藥研發企業提供生物(wù)藥物(wù)技(jì )術研發服務(wù)，同時與多(duō)家知名醫(yī)藥公司達成戰略合作(zuò)。

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