穩定細胞株作(zuò)為(wèi)生物(wù)制藥CMC的基礎工作(zuò)，一向被重視和矚目，正所謂“成也蕭何，敗也蕭何”，一個好的細胞株往往能(néng)使得後續的工藝開發工作(zuò)事半功倍，大幅降低抗體(tǐ)/重組蛋白的生産成本；反之則需要花(huā)費更多(duō)的時間去進行上遊工藝的優化和改善，既延長(cháng)了項目時間，又花(huā)費了更多(duō)的資金。今天的皓奇星欄目我們便來介紹一下細胞株構建的流程。

CHO細胞曆史悠久，并擁有龐大的家族。從1919年，北京協和醫(yī)學(xué)院的Dr. E.T. Hsieh 在北京郊外抓了一些中國(guó)倉鼠用(yòng)作(zuò)動物(wù)模型開始，一直到1948年12月，由美國(guó)醫(yī)生Robert Briggs Watson在協和醫(yī)學(xué)院的Cheng siang-Hu教授的協助下将20隻中國(guó)倉鼠趕在南京解放前送到上海，并從上海運送到紐約，最後由Victor Schwentker公司馴養成一種實驗室動物(wù)品系，中國(guó)倉鼠一直作(zuò)為(wèi)一種實驗室研究用(yòng)動物(wù)模型（想到這裏筆(bǐ)者痛心疾首，要不是那時中國(guó)處于戰亂，自己沒有能(néng)力保存，也不至于今天被ATCC和ECACC掐住脖子）。後Puck成功分(fēn)離到了中國(guó)倉鼠卵巢細胞并體(tǐ)外培養，在接下來的幾十年裏CHO細胞家族不斷壯大，被廣泛應用(yòng)于生物(wù)制藥領域。

Florian M. Wurm and Maria João Wurm.Cloning of CHO Cells, Productivity and Genetic Stability-A Discussion.

今天不同品系的CHO細胞被用(yòng)于重組蛋白的表達，其中有代表性的包括：

不同的宿主細胞在細胞株構建中的表現差異很(hěn)大，本文(wén)僅能(néng)從筆(bǐ)者有限的經驗中提供一些參考，對于初步涉及細胞株工作(zuò)的朋友，可(kě)以采購(gòu)商品化的宿主細胞試劑盒，并遵照說明書進行操作(zuò)，熟悉細胞的特性後，再自行優化篩選方式。各種宿主細胞均有各自優劣，使用(yòng)者需要考慮包括表達水平、蛋白質(zhì)量、商業授權等各方面因素，例如優勢方面，GS系統下表達量和Qp相對較高，DG44系統細胞株穩定性好，K1 篩選周期短且表達量高，CHO-S商業授權清晰；反過來缺點方面GS系統價格昂貴，DG44表達量較低，K1細胞株穩定性較差，CHO-S相對易結團等等。真正有經驗的研究人員，則可(kě)以根據不同細胞的特性，開發合适的篩選方式和培養工藝，将細胞的潛能(néng)挖掘到最大，正如俗語所說“Less is more”，細胞株構建亦然。

生産用(yòng)穩定細胞株的構建首先由表達載體(tǐ)的構建和細胞轉染開始

1、将表達抗體(tǐ)的目的基因構建到載體(tǐ)上，再将該載體(tǐ)轉染進入宿主細胞内，常見的轉染方式主要有鈣轉、電(diàn)轉、脂質(zhì)體(tǐ)轉染和逆轉錄病毒轉染，DNA進入宿主細胞核後将會随機整合到宿主細胞基因組當中去，因此表達水平與基因拷貝數、基因整合位點的轉錄活性有關。

2、接下來不同篩選試劑将被用(yòng)于篩選能(néng)夠正确表達目的基因并且高水平表達的細胞群(pool）。

3、由于此時得到的細胞群中的每個細胞特性各異，具有不同的基因整合位點、拷貝數、細胞單産和生長(cháng)速率，因此需要将其中具有高産、穩定表達特性的細胞個體(tǐ)分(fēn)離出來分(fēn)别培養，通常需要獲得數百甚至上千的候選克隆供進一步篩選。

4、被篩選出來的克隆經過傳代培養和分(fēn)批補料實驗(Fed-batch)，比較其生長(cháng)特性、代謝(xiè)狀況、表達量高低、表達産物(wù)質(zhì)量等，選出最優的幾個克隆進入生物(wù)反應器放大實驗，同步評估細胞株穩定性，最終确定生産用(yòng)單克隆細胞株。

Soo Min Noh, Seunghyeon Shin and Gyun MinLee. Comprehensive characterization of glutamine synthetase-mediated selectionfor the establishment of recombinant CHO cells producing monoclonal antibodies.

篩選标記

為(wèi)了有效地篩選出高表達的細胞，表達載體(tǐ)上除了包含抗體(tǐ)的重、輕鏈以外，往往還含有各種篩選标記，篩選标記一般可(kě)以被分(fēn)為(wèi)兩大類：一類是以G418為(wèi)代表的抗生素類篩選标記，另一類是以MTX為(wèi)代表的影響細胞代謝(xiè)的篩選标記。與此同時，高效的啓動子（如CMV）和延長(cháng)因子（如EF1α）被廣泛運用(yòng)于抗體(tǐ)表達載體(tǐ)。翻譯的起始位置是恒定的Kozak序列：GCC GCC（A/C）CC和抗體(tǐ)特異性的信号肽——不同的重輕鏈類型有各自特異的信号肽序列。

位置效應

插入染色體(tǐ)的位置影響真核基因的表達，即“位置效應”。當外源基因插入異染色質(zhì)及其附近區(qū)域産生位置效應時，此處異染色質(zhì)區(qū)域将産生位置效應斑點，此時，周圍的異染色質(zhì)将有效地阻止插入基因的表達。為(wèi)了克服“位置效應”，一般有兩種辦法：1、将目的基因定點整合到合适的位點；2、在目的基因的側翼加上“絕緣子”DNA序列，從而抑制“位置效應”。

細胞群

當目的基因被轉染到宿主細胞内，并按照一定的細胞密度在合适的篩選壓力下進行傳代培養後便得到了細胞群（pool）。細胞群的表達量取決于轉染的方式、篩選壓力的作(zuò)用(yòng)以及目的基因整合情況 。由于不同的宿主細胞在篩選條件下的特性不同，針對不同的宿主細胞，可(kě)以采取不同的細胞群篩選方式，包括是搖瓶中大規模的細胞群的篩選還是孔版中的迷你細胞群的篩選，亦或是選擇合适的篩選壓力大小(xiǎo)，目标是在較短的時間内能(néng)夠篩選得到表達量相對較高的細胞群。對于不同的項目，在細胞群階段需要考察的标準不同，對于常規新(xīn)藥抗體(tǐ)，往往表達量會成為(wèi)第一評價标準；對于生物(wù)類似物(wù)，則需在細胞群階段着重考察各項質(zhì)量參數與原研的差異；對于雙特異性抗體(tǐ)，則需要在此階段就開始考察正确裝(zhuāng)配的比例，從而降低克隆篩選階段的風險。

常用(yòng)的篩選克隆的方法

有限稀釋法因為(wèi)其低成本和易于操作(zuò)，被廣泛運用(yòng)于克隆的篩選。需要注意的是，為(wèi)符合FDA的申報要求需進行兩輪LDC，且細胞密度<0.5細胞每孔或者一輪LDC結合圖像證明，以驗證單克隆性。有限稀釋法工作(zuò)量大，往往需要運用(yòng)自動化工作(zuò)站進行高通量的篩選。

半固體(tǐ)培養基法進行單克隆的篩選。細胞生長(cháng)在半固體(tǐ)培養中，形成單克隆細胞團，同時将抗體(tǐ)分(fēn)泌在細胞團周圍，半固體(tǐ)培養基中含有熒光标記的二抗，能(néng)與抗體(tǐ)Fc片段特異性結合，當用(yòng)一定波長(cháng)的光進行激發時就能(néng)發出熒光。使用(yòng)圖像分(fēn)析軟件能(néng)夠對單克隆細胞團的大小(xiǎo)、熒光強度進行測定，從而篩選出生長(cháng)旺盛、表達量高的單克隆細胞團。自動化的機械臂能(néng)夠按照實驗人員設定的參數将符合要求的細胞團挑取出來用(yòng)于後續的擴大培養。半固體(tǐ)培養基法能(néng)夠通過自動化的方式挑取單克隆細胞，大大減輕了實驗人員的工作(zuò)負擔，但用(yòng)于熒光掃描、圖像分(fēn)析和克隆挑取的機器價格昂貴，且為(wèi)符合申報要求，需要兩輪半固體(tǐ)培養基篩選或一輪半固體(tǐ)培養基篩選結合一輪LDC進行。

流式細胞儀分(fēn)選法（FACS）。将帶有熒光标記的二抗和分(fēn)泌抗體(tǐ)的CHO細胞混合孵育，分(fēn)泌到細胞表面的抗體(tǐ)就能(néng)夠被流式細胞儀檢測到，從而利用(yòng)其分(fēn)選功能(néng)篩選出分(fēn)泌多(duō)的細胞。為(wèi)了使分(fēn)泌到胞外的抗體(tǐ)能(néng)夠維持在細胞膜表面，還可(kě)以使用(yòng)微囊将細胞以及分(fēn)泌的抗體(tǐ)包裹起來。

克隆篩選工作(zuò)往是微量、高通量，檢測和操作(zuò)手段的改善和升級非常重要，如HTRF（均相時間分(fēn)辨熒光），可(kě)以使用(yòng)較小(xiǎo)的樣品量（2.5-5.0μL）進行高通量（384孔闆）檢測，結合自動化工作(zuò)站的輔助，能(néng)夠大幅降低研發人員的工作(zuò)量。

圖3.單克隆成像系統下單克隆細胞擴增的過程（使用(yòng)MD CloneSelect Imager 拍攝） 

優秀的單克隆細胞株還要考慮到細胞生長(cháng)、表達和代謝(xiè)情況，以及目的蛋白的質(zhì)量水平。要關注乳酸和氧的代謝(xiè)，高乳酸和高耗氧可(kě)能(néng)為(wèi)細胞株在反應器的培養埋下隐患。細胞株的工藝要考慮到未來反應器中培養的可(kě)重複和可(kě)放大性，同時選擇可(kě)及性較強，批次穩定的培養基和補料。培養基的價格跟用(yòng)量高度相關，根據筆(bǐ)者的經驗，年使用(yòng)量從100L提高到10000L，培養基的單價可(kě)以相差5-10倍，大規模使用(yòng)時，進口商業化培養基的價格一般會處于100-200元/升，而假如擁有自己的CD培養基配方，委托GE、Merck或者Thermo等生産，其價格則會進一步下降到30-100元/升。因此初期大可(kě)不用(yòng)為(wèi)培養基的單價太過擔心，同時在選擇好合适的供應商後可(kě)以盡早與供應商展開量價談判，明确大規模使用(yòng)後的價格。