摘要：

繼皓奇星高表達株細胞是怎麽煉成的公衆号發布之後，相信不少讀者對如何構建細胞株有了一定的了解，一個優秀的細胞株能(néng)讓培養工藝開發工作(zuò)達到事半功倍的效果，為(wèi)盡量減短項目的早期研發時間，通常可(kě)以使用(yòng)平台化的工藝進行放大生産。那麽作(zuò)為(wèi)我們工藝人來說，除了放大研究及生産外，如何通過工藝開發，讓高表達細胞株的表達水平和産品質(zhì)量能(néng)百尺竿頭更進一步，是一項不小(xiǎo)的挑戰。

工藝開發工作(zuò)千緒萬端，每一個培養的細節都是開發需要考慮的因素，如培養基、補料、培養溫度、攪拌轉速、溶氧參數、pH參數等等，另外不同的培養方式，除傳統的補料流加培養，近年來興起的高密度接種、灌流培養等等，也是工藝開發的熱點。縱觀這些因素，培養基及補料的開發和優化，在整個工藝開發過程中至關重要，無論是傳統的批次補料培養，還是灌流培養，培養基和補料對産品的産量和質(zhì)量均有舉足輕重的影響，實際上灌流培養工藝開發的前期基礎是培養基的開發，否則從成本角度考慮幾乎體(tǐ)現不出灌流的優勢。本期皓奇星欄目将接力細胞株構建，從細胞生命規律的角度，一起學(xué)習培養基是如何發揮作(zuò)用(yòng)的。

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培養基成分(fēn)概述

細胞吸收營養物(wù)質(zhì)，合成自身組成物(wù)質(zhì)，最後進行增殖需要一定的物(wù)質(zhì)基礎，如水、無機鹽等無機物(wù)和蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、糖類等有機物(wù)，這些物(wù)質(zhì)基礎構成了細胞的結構基礎，如細胞膜，細胞質(zhì)，細胞器，細胞核等等。隻要培養的是具有生長(cháng)和增殖能(néng)力的細胞，就必須提供基本濃度的這些物(wù)質(zhì)基礎，而我們構建的CHO細胞作(zuò)為(wèi)生産工廠，顯然需要添加更多(duō)的營養成分(fēn)去支持目的産物(wù)的合成。培養基的成分(fēn)非常複雜，主要包含氨基酸、維生素、無機鹽、微量元素、碳水化合物(wù)、油脂、激素、生長(cháng)因子等等。各類成分(fēn)的作(zuò)用(yòng)及添加情況見下表。

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能(néng)量代謝(xiè)及能(néng)源物(wù)質(zhì)

細胞的一切生命活動都離不開能(néng)量，其生長(cháng)增殖和蛋白表達需要消耗大量的能(néng)量，有研究表明每個細胞的平均幹重大概在400pg，其中50%以上成分(fēn)為(wèi)蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)合成主要是氨基酸通過肽鍵連接而成，每一個肽鍵的合成需要消耗3個ATP能(néng)量，而氧化一分(fēn)子葡萄糖最終才産生約30個ATP能(néng)量，可(kě)見細胞就合成自身蛋白需要消耗多(duō)少能(néng)量，而一個高表達細胞株Qp能(néng)達到50pg以上，即每個細胞每天表達50pg蛋白，占到自身總蛋白近1/4。

葡萄糖作(zuò)為(wèi)培養基中最主要的能(néng)源物(wù)質(zhì)被細胞吸收利用(yòng)。它首先通過質(zhì)膜上的轉運蛋白進入細胞，在胞質(zhì)内經多(duō)個步驟被分(fēn)解為(wèi)丙酮酸，這個過程稱為(wèi)糖酵解，其中一部分(fēn)丙酮酸進入線(xiàn)粒體(tǐ)被完全氧化為(wèi)水和二氧化碳并産生能(néng)量的過程即為(wèi)TCA循環，TCA循環是細胞産生能(néng)量的主要方式，在細胞快速生長(cháng)階段，大部分(fēn)丙酮酸（約90%）是在乳酸脫氫酶的作(zuò)用(yòng)下生成乳酸并分(fēn)泌到胞外，所以這個階段會出現乳酸的積累，降低了葡萄糖的利用(yòng)效率。除此之外，葡萄糖通過磷酸戊糖途徑可(kě)産生磷酸核糖，磷酸核糖是合成核苷酸的重要原料。

谷氨酰胺是僅次于葡萄糖的第二大能(néng)源物(wù)質(zhì)，谷氨酰胺除了用(yòng)于合成細胞自身物(wù)質(zhì)及目的蛋白外，大部分(fēn)的谷氨酰胺被轉化成谷氨酸，谷氨酸進一步轉變成α酮戊二酸後進入TCA循環産生能(néng)量。需要注意的是GS系統的CHO細胞，由于轉入了外源性的谷氨酰胺合成酶基因，所以不需要從外界獲取谷氨酰胺，其表達的谷氨酰胺合成酶可(kě)将谷氨酸合成谷氨酰胺。

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氨基酸代謝(xiè)及氨基酸類添加成分(fēn)

氨基酸是細胞合成蛋白的分(fēn)子基礎，包括結構功能(néng)蛋白和目的蛋白。氨基酸分(fēn)為(wèi)必須氨基酸和非必須氨基酸，非必須氨基酸可(kě)由哺乳動物(wù)細胞合成，必須氨基酸細胞不能(néng)自身合成，必須由外環境提供，在培養基開發過程中，由于目的産物(wù)表達水平較高，細胞自身合成非必須氨基酸的速率一旦跟不上目的蛋白的合成速率，則容易發生錯配影響産物(wù)的表達，所以一般會添加所有約20種氨基酸。氨基酸濃度的優化是培養基開發中最重要的環節，其濃度的微小(xiǎo)改變就能(néng)顯著影響細胞的生長(cháng)和蛋白的表達。當然，在重組細胞中，大部分(fēn)氨基酸用(yòng)于合成蛋白質(zhì)，還有一部分(fēn)氨基酸被用(yòng)于合成其它物(wù)質(zhì)，如核酸和脂類物(wù)質(zhì)。

氨基酸的代謝(xiè)由于有共同的結構特點，因此有很(hěn)多(duō)共同之處，但不同的氨基酸由于結構上的差異，代謝(xiè)有不同之處，主要代謝(xiè)去向如下表統計。

從上表能(néng)看出，由于大部分(fēn)的氨基酸通過脫氨基作(zuò)用(yòng)産生相應的α酮酸和氨根離子，因此氨根的積累是細胞培養中不可(kě)忽略的因素。此外，某些氨基酸通過轉氨基作(zuò)用(yòng)可(kě)以生成其它氨基酸，這些氨基酸既屬于非必須氨基酸。需要注意的是，由于酪氨酸和半胱氨酸的難溶性問題，一般以堿溶液的方式進行補料添加，現在市場上已有一些易于溶解的替代品，如默克開發的磷酸酪氨酸二鈉鹽和L半胱氨酸硫酸鈉鹽。

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維生素及其功能(néng)

細胞的一切生命活動離不開生物(wù)催化劑酶，維生素作(zuò)為(wèi)酶的結合劑，與酶結合後催化細胞的生理(lǐ)活動，如代謝(xiè)，能(néng)量轉移等等，培養細胞本身無法合成維生素，因此培養基中維生素是必須添加的一類物(wù)質(zhì)，尤其是B族維生素，如硫胺素、核黃素、泛酸、吡哆醇、生物(wù)素、葉酸、氰钴胺素、肌醇和維生素C等。細胞培養過程中常用(yòng)的維生素功能(néng)如下表所示。

有些培養基中會适量添加脂溶性維生素如生育酚，視黃醇或者添加維生素D的前體(tǐ)物(wù)質(zhì)如膽固醇，盡管這些脂溶性維生素對細胞的生長(cháng)有一定的影響，考慮其添加的複雜性及難溶性，一般不考慮優化這些成分(fēn)。

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無機鹽及其對細胞的影響

細胞質(zhì)基質(zhì)作(zuò)為(wèi)細胞質(zhì)溶膠填充于有形結構之間，化學(xué)組成主要包括水、無機鹽，脂類、糖類、氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)等，為(wèi)各種細胞器維持其正常結構和功能(néng)提供合适的離子環境及物(wù)質(zhì)底物(wù)。所以合适的無機鹽濃度是細胞維持滲透壓及電(diàn)位環境必須的。培養基中常見的無機鹽包括鈉、鉀、鎂、鈣、氯離子、磷酸鹽、硫酸鹽、碳酸氫根等。其中鈣離子在胞内信号轉導中發揮着重要的作(zuò)用(yòng)。磷酸鹽除了作(zuò)為(wèi)緩沖鹽之外，也是是核苷酸、核酸與磷脂的組成成分(fēn)之一。鎂離子作(zuò)為(wèi)ATP的共轭離子，其在培養基中的添加濃度較高，通常是mM級别添加。需要注意的是有文(wén)獻報道合适的鈉鉀濃度比是細胞維持正常生理(lǐ)活動的基礎。

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微量元素及其主要作(zuò)用(yòng)

微量元素也作(zuò)為(wèi)輔酶因子參與調節細胞的生理(lǐ)活動，在培養基開發的早期階段，由于培養基配制使用(yòng)水的純度較低，其包含了一定程度的微量元素，現在由于配制水的純度大幅度提升，使得微量元素的開發顯得越發重要，培養基中常用(yòng)的微量元素包括鋅、銅、鐵、錳、硒、钼等。

鐵是鐵硫蛋白、過氧化物(wù)酶及過氧化氫酶的重要組成部分(fēn)，在氣體(tǐ)運輸、生物(wù)氧化和酶促反應中發揮重要的作(zuò)用(yòng)。一般鐵離子以絡合物(wù)的形式被細胞利用(yòng)，遊離的或無效的螯和鐵對細胞可(kě)能(néng)産生毒性，另外培養基中的超氧自由基或維生素C等還原劑可(kě)将三價鐵還原為(wèi)二價鐵。考慮轉鐵蛋白的來源及成本問題，現在普遍用(yòng)檸檬酸鐵氨作(zuò)為(wèi)鐵源加入到培養基中。

鋅是含鋅金屬酶的組成成分(fēn)，它與蛋白的折疊相關，能(néng)與蛋白質(zhì)的二硫鍵有效結合，影響蛋白的穩定性和活性，在RNA/DNA合成、mRNA穩定及細胞抗凋亡過程中起到了不可(kě)或缺的作(zuò)用(yòng)，鋅離子同時還參與了谷胱甘肽和抗氧化酶如超氧化物(wù)歧化酶和過氧化氫酶的活化，可(kě)保護細胞免受ROS的攻擊。有文(wén)獻報道鋅離子濃度添加至25mg/L可(kě)以提高CHO蛋白的表達。需要注意的是，當在培養基受到氧化應激後，鋅離子可(kě)能(néng)與培養基中的氧化物(wù)、過氧化物(wù)和硫化物(wù)形成沉澱物(wù)而流失，培養基中其它成分(fēn)如EDTA也可(kě)能(néng)會因為(wèi)螯和作(zuò)用(yòng)降低鋅的利用(yòng)率。

銅離子在培養基中以一價還原銅和二價氧化銅的平衡存在，它可(kě)以氧化培養基中其它成分(fēn)如半胱氨酸和維生素C，可(kě)與胱氨酸形成螯合物(wù)沉澱而導緻緻細胞培養基中半胱氨酸和胱氨酸的損失。培養基中半胱氨酸缺失後可(kě)停止蛋白和谷胱甘肽的合成。另外，某些細胞系中，培養過程中從乳酸生成向乳酸消耗的切換需要一定濃度的銅離子存在。

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脂質(zhì)和脂質(zhì)代謝(xiè)

脂質(zhì)是細胞膜的主要組成之一，細胞膜保證了細胞内環境的相對穩定，同時調節和選擇相應物(wù)質(zhì)進出細胞，是物(wù)質(zhì)自由進出細胞的屏障，在物(wù)質(zhì)運輸和蛋白分(fēn)泌過程中也起了很(hěn)重要的作(zuò)用(yòng)。細胞膜組成十分(fēn)複雜，主要含甘油磷脂、鞘磷脂、糖脂、膽固醇、蛋白質(zhì)和碳水化合物(wù)等，其中甘油磷脂中以磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸含量最高，其合成的基本原料為(wèi)甘油、脂肪酸、磷酸鹽、膽堿、絲氨酸和肌醇等，而鞘磷脂的主要合成原料包括脂酰CoA和絲氨酸，此外還需要吡哆醛等輔酶的參與。所以培養基中需要添加膽堿、乙醇胺、肌醇等等這些原料成分(fēn)。

脂肪酸和甘油主要由葡萄糖代謝(xiè)轉化而來，哺乳動物(wù)細胞因為(wèi)不能(néng)合成9碳以上的不飽和鍵，在培養基中可(kě)以添加适量濃度的亞油酸和亞麻酸，或者花(huā)生四烯酸等，但考慮到這些物(wù)質(zhì)的來源問題，及添加的複雜性，需謹慎開發。膽固醇作(zuò)為(wèi)細胞膜的基本結構成分(fēn)之一，是決定細胞膜性質(zhì)的一種重要成分(fēn)，同時可(kě)以轉化為(wèi)脂溶性維生素D3的前體(tǐ)。

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抗氧化物(wù)質(zhì)

所有細胞在培養過程中均會發生氧化應激，産生氧化中間産物(wù)，在無血清培養基體(tǐ)系中因缺乏抗氧化物(wù)質(zhì)而更明顯，随着活性氧濃度的增加會産生超氧自由基和過氧化氫，這些分(fēn)子會損傷脂類、蛋白和DNA使細胞受到傷害。細胞存在兩類抗氧化系統，一類是酶抗氧化系統，包括超氧化物(wù)歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物(wù)酶，另一類是非酶抗氧化體(tǐ)系，維生素C、維生素E、谷胱甘肽、硫辛酸、類胡蘿蔔素、微量元素銅、鋅、硒等。在培養基設計的時候一方面需要使用(yòng)抗氧化物(wù)質(zhì)使細胞能(néng)有對抗氧化環境的能(néng)力，另一方面是減少培養基中不穩定成分(fēn)被氧化的概率。

谷胱甘肽作(zuò)為(wèi)培養基中常添加的抗氧化物(wù)質(zhì)，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成。在重組蛋白表達過程中，目的蛋白表達越多(duō)，細胞需要應對的氧化應激越顯著，産生越多(duō)的氧化型谷胱甘肽，有文(wén)獻報道氧化型谷胱甘肽的累積是細胞死亡的早期凋亡信号，是除了氨根和乳酸之外引起細胞凋亡的另一因素。

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核苷類物(wù)質(zhì)

細胞合成嘌呤和嘧啶核苷酸需要氨基酸作(zuò)為(wèi)原料，如嘌呤的合成需要甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺及一碳單位，嘧啶的合成需要天冬酰胺、谷氨酰胺及一碳單位，這是細胞合成核苷酸的其中一條途徑，即從頭合成途徑，另一條是補救途徑，即以現成的核苷和堿基為(wèi)基礎合成核苷酸。DHFR能(néng)将二氫葉酸還原為(wèi)四氫葉酸，而四氫葉酸是核苷酸從頭合成途徑的一個關鍵底物(wù)，DHFR缺陷型細胞因此無法從頭合成核苷酸，需在培養基中添加現成的核苷類物(wù)質(zhì)如次黃嘌呤和胸苷才能(néng)存活。CHO-DHFR細胞的設計就是基于這個原理(lǐ)，通過外源性插入DHFR和目的基因，即可(kě)在無次黃嘌呤和胸苷的培養基中生長(cháng)，同時添加DHFR抑制劑可(kě)增加DHFR和目的基因的拷貝數。一般核苷類物(wù)質(zhì)占細胞幹重的比例很(hěn)低，不超過5%，且細胞自身能(néng)合成，所以培養基中的添加量很(hěn)低或不添加。

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生長(cháng)因子

生長(cháng)因子可(kě)促進細胞的生長(cháng)和增殖，如胰島素，能(néng)調節細胞的代謝(xiè)過程，促進細胞對葡萄糖的吸收和利用(yòng)，同時能(néng)促進脂肪酸和蛋白質(zhì)的合成，一般培養基中會添加，但是考慮培養基成本，現在普遍尋求能(néng)替代的化合物(wù)。

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其它成分(fēn)

細胞培養理(lǐ)化環境除了提供合适的滲透壓之外，還需要合适的粘度，培養基中常用(yòng)的F68，是一類聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物(wù)，屬非離子表面活性劑，具有洗滌和消泡功能(néng)，其聚氧乙烯的比例越大，則親水性越強，細胞緩沖效果越好，洗滌活性也越強，而聚氧丙烯的比例越大則消泡能(néng)力越強，當然毒性也越大。培養基中添加1-2g/L濃度的泊洛沙姆在細胞抗剪切力方面有較好的效果，但缺點是容易形成泡沫。緩沖劑為(wèi)培養基提供了穩定的pH範圍，常見的緩沖劑包括碳酸鹽，磷酸鹽緩沖體(tǐ)系以及HEPES。硫酸葡聚糖作(zuò)為(wèi)抗結團劑也是培養基中常見的一種添加劑。

細胞代謝(xiè)錯綜複雜，涉及到的成分(fēn)千千萬萬，如何使用(yòng)有限的成分(fēn)開發出優秀的培養基，是工藝人一直面臨的難題之一。需要我們首先從科(kē)學(xué)的角度出發，了解細胞的基本生命規律，熟悉基本生命物(wù)質(zhì)的來龍去脈，再是借鑒前期的研究成果，培養基發展的前世今生經曆了多(duō)少代科(kē)學(xué)家的不懈努力，在此基礎上精(jīng)益求精(jīng)，才能(néng)走的更遠(yuǎn)，最後需要借助現代化的分(fēn)析檢測技(jì )術，分(fēn)析物(wù)質(zhì)的消耗和産出，從化學(xué)計量角度去實現細胞産能(néng)的最大化和最優化。

參考文(wén)獻：

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2. Impact of CHO Metabolism> Metabolites and Nutrients Amino Acid Metabolism Biotechnol. J. 2018, 13, 1700499

3. Cell Culture Media for Recombinant Protein Expression in Chinese Hamster Ovary (CHO) Cells: History, Key Components, and Optimization Strategies DOI 10.1002/btpr.2706 Published align="left">4. Impact of CHO Metabolism align="left">5. Zinc supplementation increases protein titer of recombinant CHO cells Cytotechnology https://doi.org/10.1007/s10616-019-00334-1 (0123456789().,-volV() 0123458697().,-volV)