摘 要

生物(wù)制藥CMC通常包含四個模塊：上遊培養、下遊純化、制劑灌裝(zhuāng)和分(fēn)析質(zhì)控。下遊純化是将上遊得到的細胞培養液澄清後，進行純化生産從而得到原液的過程。

那麽為(wèi)了在固定的工藝下使産品質(zhì)量達到預期，就需要确認工藝參數的操作(zuò)範圍，通過工藝設計來控制對藥品安(ān)全性和有效性有顯著影響的關鍵屬性。實驗設計(DOE)是一種設計實驗并分(fēn)析所獲得信息的技(jì )術。這種技(jì )術可(kě)以使我們在最小(xiǎo)數量的實驗中建立實驗參數與結果的數學(xué)模型，找到最佳工藝條件，确定工藝的操作(zuò)窗口。

本期皓奇星我們便來介紹一下DOE的實驗設計方法及其在下遊層析工藝中的應用(yòng)。

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什麽是DOE？

實驗設計(DOE，Design Of Experiment)，是研究和處理(lǐ)多(duō)因子與響應變量關系的一種方法。它通過合理(lǐ)地挑選實驗條件，安(ān)排實驗，并通過對實驗數據的分(fēn)析，從而建立響應與因子之間的函數關系，或者找出總體(tǐ)最優的改進方案。它可(kě)以用(yòng)最少的實驗數量得到最大的信息量并可(kě)以發現各個因子之間的交互作(zuò)用(yòng)，探索整個實驗區(qū)間。

在工藝開發期間，利用(yòng)DOE的實驗方法我們可(kě)以在衆多(duō)影響響應值Y值的因子X中确定哪些對響應有顯著影響，确定如何改變這些因子的取值使響應達到最佳值。DOE實驗通過對實驗結果的分(fēn)析獲得傳遞函數，得到Y與各因子X的關系式。采用(yòng)DOE的方法，因子X的範圍選擇廣，且可(kě)以進行精(jīng)确的控制，這也使得DOE實驗可(kě)以探索到整體(tǐ)的最佳方案，使實驗結果取得突破性的改善。

02

DOE的基本術語

因子：所有可(kě)能(néng)影響實驗結果的參數。通常可(kě)被控制，但也可(kě)能(néng)不可(kě)控制即噪聲因子。該參數既可(kě)以是數值也可(kě)以為(wèi)種類，比如層析過程中的pH、電(diàn)導率、鹽類型、填料種類等。

響應：一個或多(duō)個可(kě)測量的變量描述的實驗結果。比如層析過程中的回收率、純度、HCP含量等。

模型/傳遞函數：在變量統計分(fēn)析的基礎上建立的數學(xué)模型。可(kě)以描述工藝參數X與響應值Y的關系，并對不可(kě)測量的因子采用(yòng)預測響應，可(kě)以量化随機變化的大小(xiǎo)。

下圖列舉了部分(fēn)層析過程中涉及到的因子X和響應值Y。

03

DOE的一般步驟

● 明确目的，通過曆史數據或經驗确定實驗目标。

● 确定實驗的輸出結果響應值Y；确定因子X及其水平。

● 确定每個實驗因子X的實際取值，并确定實驗計劃。

● 按照實驗計劃随機進行實驗，并測量輸出值Y。

● 整理(lǐ)、分(fēn)析數據，進行方差分(fēn)析和回歸分(fēn)析。找出主要影響因素并确定因子X和響應Y的關系式。

● 确定最優的因子組合。

● 在最優的因子組合範圍内重複實驗，進行驗證。

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DOE常見設計優缺點比較

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案例分(fēn)析

在皓陽生物(wù)某融合蛋白的親和捕獲過程中，由于細胞培養液中蛋白表達量高且聚集體(tǐ)含量較高，很(hěn)難達到親和洗脫液HPLC-SEC純度和回收率的平衡的情況。于是，采用(yòng)DOE實驗設計進行洗脫條件的優化，試圖找到回收率和HPLC-SEC純度均大于90%的工藝操作(zuò)窗口。

首先，确定響應值Y為(wèi)回收率和HPLC-SEC純度；根據經驗确定因子X為(wèi)洗脫緩沖液的pH（範圍3.0-3.8）及鹽濃度（範圍20mM-100mM）；選擇響應曲面設計中CCF模型進行2因素2水平的實驗設計，共設計了11組實驗（3組中心點）。按照模型列出的實驗條件進行親和層析，收集洗脫液并進行HPLC-SEC純度檢測和回收率的計算，将響應值Y的結果回輸并進行統計學(xué)分(fēn)析。                                              

DOE實驗結果表明，洗脫液pH及鹽濃度均為(wèi)親和捕獲工藝中純度和回收率的顯著影響因素，在實驗條件範圍内，pH越高，收率越低，純度越高。

為(wèi)了進一步驗證DOE實驗優化得到的最優洗脫條件，将層析柱直徑放大至5cm并用(yòng)該洗脫條件重複實驗，實驗結果均達到預期。最終确定了親和層析洗脫緩沖液pH及鹽濃度區(qū)間範圍，獲得的目标蛋白純度>90%，回收率>90%。該工藝經過10L反應器培養液進行放大驗證後，成功應用(yòng)于3批200L中試生産，工藝方法穩定可(kě)行。

随着生物(wù)行業的不斷發展，産品種類繁多(duō)，各種複雜類型的雙抗和融合蛋白的開發必将為(wèi)下遊純化工藝帶來挑戰和考驗。結合實際需求，善用(yòng)DOE等實驗工具，相信再荊棘叢生的路，也終究會豁然開朗，柳暗花(huā)明。