皓陽生物(wù)基于可(kě)商業化授權的CHO-K1細胞株，結合自有的質(zhì)粒系統以及細胞株篩選方案，建立皓越®穩定細胞株平台，2021年至今已為(wèi)國(guó)内外客戶完成超過50個單抗、雙抗以及融合蛋白穩定細胞株構建項目。在常規培養條件下，項目平均表達量大于6.7g/L，高效助力客戶項目更快更好推進。2022年，基于皓越®的基礎上進一步打造Fut8敲除的ADCC加強型穩定細胞株構建平台，為(wèi)客戶提供更多(duō)元的選擇與服務(wù)。

現在，皓陽正式推出“4g保底，挑戰無上限”的穩定細胞株開發服務(wù)！為(wèi)對稱結構的單/雙抗提供4g/L的保底細胞株構建服務(wù)。為(wèi)實現全球穩定細胞株構建第一品牌的願景，歡迎客戶将皓陽的服務(wù)同步與國(guó)内外任何同行做同步對比。

雙特異性抗體(tǐ)（bispecific antibody，bsAb）是一類能(néng)識别兩種位點或能(néng)與兩種抗原進行結合的非天然抗體(tǐ)結構，從由linker連接的兩個最小(xiǎo)抗原結合片段，到IgG結構基礎上交聯額外的結構域的“大型”分(fēn)子，科(kē)學(xué)家們的奇妙構思造就了琳琅滿目的精(jīng)巧架構，賦予了理(lǐ)論上“1+1大于2”的能(néng)力——bsAb能(néng)表現出單獨的親本抗體(tǐ)或混合的“雞尾酒療法”不可(kě)比拟的性質(zhì)和潛力。如在最為(wèi)廣泛的應用(yòng)領域之一——腫瘤的免疫治療上，bsAb能(néng)同時結合兩個位點，發揮阻斷腫瘤細胞信号通路，介導免疫細胞殺傷靶細胞等功能(néng)，降低單抗的“脫靶”效應，減少腫瘤細胞逃逸。由于bsAb的種種優越性，近年來一直受到業内的高度關注，也成為(wèi)癌症，炎症，自身免疫病等多(duō)種疾病的開發熱點。

随着行業發展，從第一個上市的Catumaxomab起，Amgen的Blinatumomab和Roche的Emicizumab相繼獲批，近期國(guó)家藥品監督管理(lǐ)局（NMPA）官網公示，由康方生物(wù)自主研發的PD-1/CTLA-4 雙特異性抗體(tǐ)Candonilimab獲批上市。可(kě)以預見，未來的賽道上湧現的bsAb明星将會越來越多(duō)，而将一個promising的bsAb從實驗室推動到臨床及上市，真正造福患者，從CMC的角度，需要高屋建瓴的設計與思考。

通過剖析與歸納bsAb的結構，可(kě)分(fēn)為(wèi)具備Fc區(qū)的IgG-like bsAb及不具備Fc區(qū)的non-IgG-like bsAb，其中IgG-like bsAb又分(fēn)為(wèi)對稱（Symmetric）和非對稱結構（Asymmetric）。Catumaxomab和Emicizumab是IgG-like bsAb的典型代表，這類bsAb在CMC上的優勢在于溶解性和穩定性較好，劣勢在于有些複雜結構會帶來較高的聚體(tǐ)、錯配、得率低等問題；Blinatumomab則屬于non-IgG-like bsAb一類，這類bsAb在CMC上的優勢在于結構簡單，一般表達量較高，劣勢則在于需要開發特定的純化技(jì )術路線(xiàn)等。

如何能(néng)在IND階段順利完成bsAb的開發工作(zuò)，需要從以下幾個重點考慮：

01

細胞株開發

基于QbD理(lǐ)念及現實因素考慮，對于整個CMC而言，一個“天資卓越”的細胞株重要程度不言而喻，它是整個CMC的起點和基礎。高效穩定細胞株兼具表達量高，産品質(zhì)量好（錯配/聚體(tǐ)低等），穩定性好等特性。這些特性直接影響到後續工藝開發、生産可(kě)及性和生産成本的控制。皓陽在2021~2022年間開發了15個bsAb項目，涵蓋7種不同結構的經驗，見圖1。目前針對bsAb的細胞株開發，皓陽多(duō)維度做了更多(duō)的考慮和設計，主要體(tǐ)現在表達載體(tǐ)設計、宿主細胞選擇、檢測方法和篩選方式的設計和選擇上。

圖1 bsAb結構-表達量彙總注：商業化CD培養基常規14天Fed-batch培養工藝；紅點為(wèi)Top clone titer；綠點為(wèi)Top pool titer。

針對不同結構的bsAb個性化的載體(tǐ)構建策略，在細胞株開發早期高通量的檢測bsAb的純度和正配率，在細胞株篩選過程中确定關鍵指标和技(jì )術點，以盡可(kě)能(néng)的保障能(néng)篩選到表達較優bsAb的細胞株，一個Asymmetric formats bsAb開發實例如下：
通過轉染及高通量minipool篩選，得到一批細胞群，表達及質(zhì)量情況如下表

其中minipool B在正配率和表達量上較其餘minipool有顯著優勢，SEC純度在可(kě)接受範圍内，挑選minipool B進行單克隆篩選，細胞株表達及一步親和純化後質(zhì)量情況如下表

由此可(kě)見，通過前期獲得正配率較高，表達量較優的細胞群，後續篩選出理(lǐ)想的細胞株概率大幅提升，極大程度的減低了該Asymmetric formats bsAb後續工藝開發的難度。

02
上遊工藝開發

誠然，獲得一個表達高質(zhì)量蛋白的細胞株對于bsAb後續開發是相對事半功倍的，但往往會存在沒有篩到理(lǐ)想細胞株的情況。細胞株開發是相對耗時費力的限速步驟，反複重複該部分(fēn)工作(zuò)，結果的不确定性極大，因此帶來難以考量時間和經濟成本。上遊工藝開發可(kě)及時介入，以期通過後天的培養條件優化改善産物(wù)質(zhì)量，一個開發實例如下。
如圖1中結構1所展示的Symmetric formats bsAb，由于分(fēn)子結構的複雜性導緻蛋白分(fēn)泌時出現斷裂，且碎片無法經純化有效的去除，針對該熱門靶點結構分(fēn)子，不同公司采取了不同的處理(lǐ)手段，如通過對細胞因子序列的改造減少斷裂（WO2018205985A1）。該項目在未經序列優化的情況下，通過高通量細胞株篩選對于斷裂情況無有效改善，在選定top clone後，結合培養基開發和細胞培養工藝優化，成功降低了bsAb斷裂比例，對碎片含量進行了有效控制，提高了純化收率。後續三批中試生産收率達到65%-70%，與單抗基本一緻。

03
下遊工藝開發

與單抗相比，bsAb具有更加多(duō)樣化的分(fēn)子結構與更加複雜的副産物(wù)，如同源二聚 （Homodimer）、重-輕鏈錯配（Heterodimeric Fc species）、半抗（Half antibody）、輕鏈二聚體(tǐ)、重鏈二聚體(tǐ)（light chain dimer，heavy chain dimer）等，對下遊純化工藝提出了更高的挑戰。現階段bsAb的純化策略依然主要依賴于層析技(jì )術。不同于單抗的經典三步層析策略，bsAb沒有固定的純化套路，一個好的bsAb純化策略需同時考慮副産物(wù)去除、目的蛋白收率、成本以及工藝的可(kě)放大性。

快速有效的完成bsAb純化策略研究，首先需要了解目的蛋白的分(fēn)子結構與性質(zhì)，知己知彼，方能(néng)百戰不殆。bsAb通常具有特殊的分(fēn)子設計，以提高其正确配對率，減少副産物(wù)的産生。有時可(kě)以增加bsAb與副産物(wù)之間的差異性，提高層析步驟的分(fēn)辨率；其次根據已有的平台方法，選擇合适的層析工藝去除雜質(zhì)；最後整體(tǐ)考量工藝對雜質(zhì)的去除能(néng)力，制定純化策略。一般的純化工藝包含捕獲、粗純、精(jīng)純三個步驟。在bsAb純化策略的制定上也可(kě)對其進行借鑒，評估每個層析工藝對不同雜質(zhì)的去除能(néng)力，考慮每個步驟輸入條件與輸出結果，有效連接各個層析工藝，從而達到制備合格産品的目的。一個Asymmetric formats bsAb開發實例如下。

通過高通量細胞株篩選，獲得的細胞株表達量較高，但蛋白質(zhì)量與原研有所差異。通過下遊工藝去除錯配體(tǐ)，精(jīng)純後蛋白質(zhì)量與原研高度相似。

bsAb作(zuò)為(wèi)抗體(tǐ)治療領域的新(xīn)興概念，受到持續且矚目的關注。多(duō)家企業已進行bsAb的戰略化布局，雖然目前多(duō)數處于研發階段，但可(kě)以預見後續的bsAb賽道将會越來越擁擠。而克服bsAb産業化過程中面臨的種種挑戰，需要各方攜手并進，通盤考慮。相信未來會有更多(duō)的療效強、副作(zuò)用(yòng)低的bsAb進入市場，為(wèi)患者帶來更多(duō)的選擇和希望。

參考文(wén)獻

[1] Bispecific antibodies: a mechanistic review of the pipeline. Nat Rev Drug Discov 18, 585–608 (2019). https://doi.org/10.1038/s41573-019-0028-1[2] A roadmap for lgG-like bispecific antibody purification,DOI:10.1016/B978-0-08-103019-6.00008-4,(2020)[3] Alkaline cation-exchange chromatography for the reduction of aggregate and a mis-formed disulfide variant in a bispecific antibody purification process, DOI:10.1016/j.jchromb.2014.11.002,(2015)[4] Analytical characterization of a monoclonal antibody therapeutic reveals a three-light chain species that is efficiently removed using hydrophobic interaction chromatography, DOI:10.4161/mabs.26192,(2013)[5] Current trends and challenges in the downstream purification of bispecific antibodies, DOI:10.1093/abt/tbab007,(2021)

關于皓陽生物(wù)

杭州皓陽生物(wù)技(jì )術有限公司成立于2015年，專注于為(wèi)抗體(tǐ)/重組蛋白客戶提供早期成藥性評估、抗體(tǐ)藥物(wù)偶聯開發、穩定細胞株構建、工藝開發、中試生産、IND申報和臨床樣品生産，培養基開發定制等多(duō)平台一站式研發服務(wù)。在上海杭州兩地設有研發中心和生産基地，目前擁有員工200餘人。上海研發中心依托多(duō)種分(fēn)析手段和瞬時表達平台為(wèi)客戶提供從人源化設計，活性分(fēn)析到成藥性分(fēn)析多(duō)維度的分(fēn)子設計和評估。杭州中心擁有自主開發可(kě)授權的高表達穩定細胞株平台（皓越）和工藝開發平台，建有完善的250L和500L規模原液和成品GMP生産線(xiàn)，能(néng)夠在8個月左右提供從DNA到毒理(lǐ)批樣品交付，12-15個月内完成IND申報準備工作(zuò)。同時公司還在建6*2000L商業化生産線(xiàn)，預計于2024年底陸續投入使用(yòng)。皓陽生物(wù)緻力于通過幫助新(xīn)藥研發，推動生物(wù)醫(yī)藥領域的進步，實現創新(xīn)為(wèi)民(mín)、科(kē)技(jì )惠民(mín)的目标。
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